T7 RNA 聚合酶在含有 T7 启动子序列的双链 DNA 存在下催化 RNA 的合成。它是从用含有 T7 RNA 聚合酶基因的质粒转化的大肠杆菌中分离出来的。该酶以甘油为基础的储存缓冲液提供，含有：20 mM 磷酸钾 pH 7.5、100 mM NaCl、1.0 mM EDTA、10 mM DTT、0.2% Triton X-100 和 50% 甘油。或者，它也提供在含有 1.0 M 海藻糖而不是甘油的相同缓冲液中（适用于冻干）。浓度 70,000 单位/mL。 请咨询定制浓度和批量。 应用： 荧光或放射性标记的 RNA 探针的制备 制备用于分析或体外翻译的大 RNA 转录物 RNA 的扩增（结合 AMV RT 和核糖核酸酶 H.） 反义 RNA 的制备 核酶的制备 用于剪接的 mRNA 前体的制备 制备用于 RNA 干扰或沉默的 ds RNA 在 RNase 保护试验中制备底物 基因组DNA测序模板的制备 用于研究 RNA 二级结构和 RNA-蛋白质相互作用的 RNA 制备 提供的试剂： 用于 T7 RNA 聚合酶的 5X 反应缓冲液 1X 反应缓冲液条件： 40 mM TrisHCl，pH 7.7 6 毫米氯化镁 10 毫米 DTT 2 mM 亚精胺 需补充： 0.5 mM ATP、CTP、GTP 和 UTP 带有 T7 启动子的 DNA 模板 （20 nM 的线性质粒 DNA 或 40 ug/mL 的 3 Kb 质粒） 在 37oC 下孵育 单位定义： 一个单位定义为在标准测定条件下，在 37oC 下 1 小时内将 3 nmol 三磷酸尿苷结合成酸不溶形式的酶量：40 mM TrisHCl，pH 7.5，30 mM MgCl2，20 mM DTT，0.4 mM GTP 、CTP、ATP、UTP 和 [3H]-UTP，20 μg/mL 非线性质粒 DNA，50 μg/mL BSA。 一般注意事项： T7 RNA 聚合酶活性需要二硫苏糖醇。反应缓冲液的这种不稳定成分可以通过补充最终浓度为 10 mM DTT 的反应来恢复。 通过将 NTP 的浓度增加到 4 mM，可以获得更高产量的 RNA。 必须注意反应中的总盐浓度不超过 50mM，因为这种酶对超过此量的盐浓度敏感。 T7 RNA 聚合酶的质量控制 1.) DNase 活性：半微克 Phi X-174 DNA 的 Hae 片段与 175 单位的 T7 RNA 聚合酶在 37oC 下孵育 3 小时，然后在天然琼脂糖凝胶中与对照阳性 DNase 1 反应同时进行电泳。检测到的 DNA 酶 1 不超过 1.25 X 10E-4 单位的当量。 2.) 核糖核酸酶活性：将 1 微克 RNA Ladder 与 280 单位的 T7 RNA 聚合酶一起孵育 2 小时，然后在天然琼脂糖凝胶中进行电泳，同时对照阳性 RNase 1A 反应。检测到的 RNase 1A 不超过 8.0 X 10E-8 单位。 3.) 比活：T7 RNA聚合酶的比活不低于400,000单位/mg。 参考： Sambrook, J.、Fritsch, E. F. 和 Maniatis, T. (1989) 分子克隆：实验室手册，（第 2 版），10.27-10.37 Sambrook, J.、Fritsch, E. F. 和 Maniatis, T. (1989) 分子克隆：实验室手册，（第 2 版），18.82-18.84